Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu:
- Lilium Oriental hybrid “Siberia” hoa trắng, thơm
- Lilium Oriental hybrid “Stagazer” hoa đỏ, thơm
- Lilium LA hybrid (Longiflorum x Asiatic) hoa vàng, không thơm
Các giống lily trên đều có nguồn gốc từ công ty Dalat Hasfarm
- Hoa đồng tiền mầu đỏ có nguồn gốc từ Tây Tựu - ĐXTT
- Hoa đồng tiền mầu hồng có nguồn gốc từ Viện Rau quả TW - HVR
- Hoa đồng tiền mầu hồng có nguồn gốc từ Vĩnh Tuy – HVT
- Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dòng EHA mang plasmid
PCAMBIA mã hoá cho gen gus và gen kháng kháng sinh hygromycin.
Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn
- Sử dụng phương pháp nghiên cứu nuôi cấy mô hiện hành
- Phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
- Phương pháp xác định sự biểu hiện tạm của gen gus theo Jefferson (1987).
Môi trường tái sinh tạo chồi lily từ vảy củ và lớp mỏng thân: MS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 1mg/l 2.4D, 0.2mg/l BA, 2g/l phytagel, pH = 5,3 - 5,5.
Môi trường tái sinh chồi đồng tiền: MS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 2mg/l BA, 0.3mg/l kinetin, 0,1mg/l IAA, 2g/l phytagel, pH = 5,2.
Hai phương pháp nhiễm mẫu với vi khuẩn
· Mẫu cấy được nhúng vào dung dịch vi khuẩn trong thời gian từ 5 phút, vớt ra, để khô trên giấy thấm vô trùng sau đó được cấy lên môi trường đồng nuôi cấy.
· Mẫu cấy được cấy trên môi trường đồng nuôi cấy sau đó dùng micropipet hút dịch vi khuẩn trên nhỏ vào mẫu, mỗi mẫu cấy chỉ nhỏ 10ml dung dịch vi khuẩn.
Phương pháp rửa vi khuẩn: Vi khuẩn được rửa 2-3 lần bằng nước cất vô trùng hoặc môi trường MS vô trùng.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Thí nghiệm 1. Xác định môi trường đồng nuôi cấy thích hợp vừa cho sự tái sinh của mẫu cấy lily đồng thời cho phép vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
Kết quả nghiên cứu của Y.Hoshi và cộng sự khi nghiên cứu quy trình tạo cây chuyển gen cho cây Oriental hybrid lily, Lilium cv. Acapulco bằng vi khuẩn Agrobacterium (2004) cho thấy: Thành phần môi trường đồng nuôi cấy trong đó có thành phần khoáng NH4NO3 có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Agrobacterium. Bên cạnh đó, cassamino acid và L-glutamine cũng có ảnh hưởng tích cực đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Ở thí nghiệm này chúng tôi tiến hành lây nhiễm bằng cả 2 phương pháp nhỏ giọt và ngâm trong dịch vi khuẩn 5 phút, nguồn mẫu cấy không qua tiền nuôi cấy. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1. Ảnh hưởng của nền môi trường đồng nuôi cấy đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium trên một số giống lily
Stt Nền môi trường Giống Phương pháp lây nhiễm Tỷ lệ sống của mẫu cấy (%) Biểu hiện vi khuẩn
Sau 8 ngày Sau 30 ngày
Nhỏ giọt Ngâm Không Có Không Có
1. MSI Ly trắng + 100 + +
2. Ly đỏ + 100 + +
3. Ly vàng + 100 + +
4. MSII Ly trắng + 100 + +
5. Ly đỏ + 100 + +
6. Ly vàng + 100 + +
Ghí chú: Mẫu cấy là vẩy củ, lớp mỏng thân
MSI: MS (1962) 20mg/l AS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 1mg/l 2.4D, 0.2mg/l BA, 3g phytagel, pH = 5,2.
MSII: MS (1962) không có NH4NO3, 20mg/l AS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 1mg/l 2.4D, 0.2mg/l BA, 1g/l cassamino acid, 700mg/l L-glutamine, 2g/l phytagel, pH = 5,2.
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy:
Thành phần NH4NO3, cassamino acid và L-glutamine có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium khi được đồng nuôi cấy với vảy củ và lớp mỏng thân của các giống lily. Sau 30 ngày theo dõi, vi khuẩn không thể phát triển được khi được đồng nuôi cấy trên môi trường MSI. Trong khi đó trên nền môi trường đồng nuôi cấy MSII chỉ sau 8 ngày vi khuẩn đã xuất hiện. Như vậy, chúng tôi sẽ sử dụng nền môi trường là MSII cho các nghiên cứu tiếp theo.
Thí nghiệm 2. Xác định ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy mẫu, phương pháp lây nhiễm đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium trên một số giống lily
Bảng 2. Ảnh hưởng của tiền nuôi cấy, phương pháp lây nhiễm đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium trên một số giống lily (theo dõi sau đồng nuôi cấy 4 ngày)
Stt Giống Thời gian tiền nuôi cấy (ngày) Phương pháp lây nhiễm Tỷ lệ sống của mẫu cấy (%) Biểu hiện vi khuẩn
5 3 2 0 Nhỏ giọt Ngâm Không Có
1. Ly trắng + + 100 +
2. Ly trắng + + 100 +
3. Ly trắng + + 100 +
4. Ly trắng + + 100 +
5. Ly trắng + + 100 +
6. Ly trắng + + 100 +
7. Ly trắng + + 100 +
8. Ly trắng + + 100 +
9. Ly đỏ + + 100 +
10. Ly vàng + + 100 +
Bảng 3. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy mẫu, phương pháp lây nhiễm đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium trên một số giống lily (theo dõi sau đồng nuôi cấy 6 ngày)
Stt Giống Thời gian tiền nuôi cấy (ngày) Phương pháp lây nhiễm Tỷ lệ sống của mẫu cấy (%) Biểu hiện vi khuẩn
5 3 2 0 Nhỏ giọt Ngâm Không Có
1. Ly trắng + + 100 +
2. Ly trắng + + 100 +
3. Ly trắng + + 100 +
4. Ly trắng + + 100 +
5. Ly trắng + + 100 +
6. Ly trắng + + 100 +
7. Ly trắng + + 100 +
8. Ly trắng + + 100 +
9. Ly đỏ + + 100 +
10. Ly vàng + + 100 +
Kết quả nghiên cứu trên bảng 2 và bảng 3 cho thấy:
Mẫu cấy lily có ảnh hưởng rất mạnh đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Agrobacterium. Sau đồng nuôi cấy 4 ngày (96 giờ), chưa có mẫu cấy nào có biểu hiện của vi khuẩn. Tiếp tục theo dõi sau 6 ngày đồng nuôi cấy. Kết quả được thể hiện trên bảng 3 cho thấy:
- Sự xuất hiện của vi khuẩn chịu ảnh hưởng rất lớn bởi thời gian tiền nuôi cấy cũng như phương pháp lây nhiễm. Nhìn chung, lây nhiễm bằng phương pháp nhỏ giọt cho phép vi khuẩn sinh trưởng và phát triển nhanh hơn so với phương pháp ngâm 5 phút trong dung dịch vi khuẩn.
- Tiền nuôi cấy mẫu trước khi lây nhiễm cũng có ảnh hưởng lớn đến sự xuất hiện của vi khuẩn Agrobacterium. Chỉ có các công thức lây nhiễm bằng phương pháp nhỏ giọt kết hợp với tiền nuôi cấy 3 hoặc 5 ngày mới cho sự xuất hiện của vi khuẩn Agrobacterium. Vi khuẩn Agrobacterium không xuất hiện khi được đồng nuôi cấy cùng với các mẫu giống lily khi các mẫu cấy này chưa qua tiền nuôi cấy. Như vậy, thời gian tiền nuôi cấy mẫu lily để vi khuẩn Agrobacterium có thể sinh trưởng phát triển là từ 3 – 5 ngày trước khi tiến hành lây nhiễm.
Thí nghiệm 3. Xác định ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy mẫu, phương pháp lây nhiễm đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium trên một số giống đồng tiền
Kết quả bảng trên bảng 4 cho thấy:
Sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium khi được đồng nuôi cấy với mẫu cấy đồng tiền không phụ thuộc vào: (1) thời gian tiền nuôi cấy, (2) Phương pháp lây nhiễm, (3) Các nguồn mẫu giống khác nhau. Rõ ràng, trên đối tượng đồng tiền, vi khuẩn Agrobacterium đã dễ dàng để có thể sinh trưởng và phát triển rất mạnh. Đây là một thuận lợi cho quá trình lây nhiễm nhưng lại là khó khăn ở giai đoạn kế tiếp. Thông thường, nếu vi khuẩn sinh trưởng và phát triển mạnh trong quá trình đồng nuôi cấy, quá trình phục hồi cũng như chọn lọc sau này sẽ rất khó khăn để loại bỏ được chính vi khuẩn này.
Bảng 4. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy mẫu, phương pháp lây nhiễm đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Agrobacterium trên một số giống đồng tiền (theo dõi sau đồng nuôi cấy 2 ngày)
Stt Giống Thời gian tiền nuôi cấy (ngày) Phương pháp lây nhiễm Tỷ lệ sống của mẫu cấy (%) Biểu hiện vi khuẩn
4 3 2 0 Nhỏ giọt Ngâm Không Có
1. HVR + + 100 +
2. HVR + + 100 +
3. HVR + + 100 +
4. HVR + + 100 +
5. ĐXTT + + 100 +
6. HVT + + 100 +
7. HVR + + 100 +
8. HVR + + 100 +
9. HVR + + 100 +
10. HVR + + 100 +
11. ĐXTT + + 100 +
12. HVT + + 100 +
Thí nghiệm 4. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đồng nuôi cấy giữa vi khuẩn Agrobacterium và mẫu cấy lily.
Đối với mỗi một đối tượng nghiên cứu, việc xác định được nhiệt độ đồng nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng của vi khuẩn sao cho có sự phát triển của vi khuẩn nhưng lại không được để vi khuẩn phát triển quá mạnh sẽ gây khó khăn cho giai đoạn tiếp theo cũng rất cần thiết.
Bảng 5. Sự phát triển của vi khuẩn khi đồng nuôi cấy với mẫu cấy lily ở nhiệt độ 210C (sau đồng nuôi cấy 6 ngày)
Stt Nhiệt độ đồng nuôi cấy Giống Tỷ lệ sống của mẫu cấy (%) Tiền nuôi cấy 3 ngày Biểu hiện vi khuẩn
Không Có
1. 210C Ly trắng 100 + +
2. 210C Ly đỏ 100 + +
3. 210C Ly vàng 100 + +
4. 240C Ly trắng 100 + +
5. 240C Ly đỏ 100 + +
6. 240C Ly vàng 100 + +
Ghi chú: Lây nhiễm bằng phương pháp nhỏ giọt
Kết quả nghiên cứu cho thấy:
Nhiệt độ nuôi cấy ở giai đoạn đồng nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn tới sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Agrobacterium. Ở nhiệt độ 210C, vi khuẩn Agrobacterium không thể phát triển được. Tuy nhiên, ở nhiệt độ đồng nuôi cấy là 240C đã cho phép vi khuẩn Agrobacterium sinh trưởng và phát triển. Như vậy, nhiệt độ nuôi cấy ở giai đoạn đồng nuôi cấy là 240C đối với mẫu cấy lily.
Thí nghiệm 5. Sự biểu hiện tạm của gen ở một số giống lily và đồng tiền
Sau khi đã xác định được nền môi trường đồng nuôi cấy, thời gian tiền nuôi cấy, thời gian đồng nuôi cấy, nhiệt độ đồng nuôi cấy, phương pháp lây nhiễm, chúng tôi tiến hành áp dụng vào thử nghiệm sự biểu hiện tạm (transient assay) của gen gus. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng sau:
Kết quả nghiên cứu cho thấy: Có sự biểu hiện tạm của gen gus trên các đối tượng là hoa lily trắng, lily đỏ và giống đồng tiền ĐXTT. Đối tượng đồng tiền cho kết quả biểu hiện tạm của gen gus rất cao, đạt 53,8%. tiếp đến là giống lily trắng (29,6%), lily đỏ (12,5%), giống lily vàng không có sự biểu hiện. Các kết quả trên đã chứng tỏ việc xác định được các thông số trong quy trình chuyển gen như: nền môi trường đồng nuôi cấy, thời gian tiền nuôi cấy, thời gian đồng nuôi cấy, nhiệt độ đồng nuôi cấy, phương pháp lây nhiễm là đúng đắn.
Kết luận
Đã nghiên cứu xác định được một số các thông số trong quy trình chuyển gen cho cây lily và đồng tiền nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Các kết quả chính bao gồm:
+ Xác định được nền môi trường đồng nuôi cấy cho cây lily là môi trường MS (1962) không có NH4NO3, 20mg/l AS, 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 3g/l phytagel, 1mg/l 2.4D, 0.2mg/l BA, 1g/l cassamino acid, 700mg/l L-glutamine, pH = 5,2.
+ Xác định được môi trường đồng nuôi cấy cho đồng tiền: MS (1962), 30g/l sucrose, 10g/l gluco, 2mg/l BA, 0.3mg/l kinetin, 0,1mg/l IAA, 1g/l cassamino acid, 700mg/l L-glutamine, 2g/l phytagel, pH = 5,2.
+ Thời gian tiền nuôi cấy thích hợp cho cây hoa lily là 3 ngày, sự lây nhiễm bằng phương pháp nhỏ giọt và nhiệt độ đồng nuôi cấy là 240C cho kết quả biểu hiện tốt của vi khuẩn.
+ Đã ghi nhận được sự biểu hiện tạm của gen gus trong mô chuyển gen của giống lily trắng, lily đỏ và đồng tiền ĐXTT.
em chĩ tìm hĩu đc coá như thế thui ah!!!